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            ELISA實驗中如何精確判斷顯色時長,TMB顯色

            2022-06-20
            367次

            監控OD620數據精確控制TMB顯色法

            原理:

            TMB顯色劑主要成分是二,二甲基聯苯胺(非致癌HRP底物),氧化失去電子后變成電子轉移復合物(TMB+TMB,復合物最大吸收峰652nm(藍色),當加入酸性物質后導致電子轉移復合物質子化,迫使兩者分離出一分子的TMB(無色),一分子TMB+(黃色琨,最大吸收峰450nm),同時酸性條件下HRP酶失活,顯色停止。

            因此652的數據正向對應450的數據,(實驗室使用620nm相對652誤差10%)。

            監控的OD620(藍色)和終止后對照450表格

            部分項目顯色控制情況:

            顯色控制,精確計算注意事項:

            1、酶標儀讀取TMB+
            450nm
            的最佳設備分辨率是3.0以下,在2.2以下有非常好的線性(2倍關系)。如果是定量,顯色不易過深,參考數據為Thermo FC酶標儀提供。注意:不同廠家的酶標儀靈敏度存在差異。

            2、使用專業的曲線軟件,推薦軟件可以在菲恩網站下載(技術支持-下載),如果是拋物線建議使用四參數方程(MMF)計算。

            3、顯色過深后(OD4503.5),TMB+濃度較高,其溶解性大大低于TMB,會緩慢形成結晶并沉淀在孔底部(黑色針狀顆粒),黃色會消退,應立即讀數。過深的顯色會在12小時后在孔底部出現大量黑色結晶,而無法保留黃色。


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